基因工程和基因组学

基因工程：是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动物和植物新品种、工业化生产生物产品、诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。

基因工程的施工有以下这些步骤：

⑴.从细胞和组织中分离DNA;

⑵.利用能识别特异DNA序列的限制性核酸内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段;

⑶.将酶切的DNA片段与载体DNA(载体能在宿主细胞内自我复制连接)，构建重组DNA分子;

⑷.将重组DNA分子导入宿主细胞，在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆;

⑸.重组DNA随宿主细胞分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝;

⑹.从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子;

⑺.使克隆的DNA进一步转录成mRNA、翻译成蛋白质，分离、鉴定基因产物。

限制性内切核酸酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切核酸酶。

重组基因载体构建的条件及要求：

1，必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。

2.具有多个限制酶切点，从而可以使不同的粘性末端与之相连，增强实用性

3.拥有标记基因是为了方便质粒进入宿主细胞后容易被检测出来，以便检测目的基因是否导入受体。

载体所需的序列结构:

目的基因：是能够产生所需蛋白质的DNA片段，比如抗虫棉就是植入能产生抗虫蛋白的目的基因。

启动子、终止子：启动子、终止子是目的基因DNA上特殊排序的碱基。RNA从启动子开始转录、翻译，到终止子结束。整个过程完成后便产生所需蛋白质。

标记基因：用于检测是否已经植入目的基因植入的成功率其实很低，所以有必要选出已经植入的个体。比如抗虫棉，判断是否植入，用种植后让虫子吃的方法判断周期太长。所以在目的基因前或后植入比如抗四环素基因(如果目的基因成功植入，抗四环素基因也一起植入)，然后用四环素来淘汰植入失败的个体，剩下的都是还有目的基因的个体。除了抗四环素基因，还有荧光基因等。

在DNA克隆中，以下材料起什么作用?

⑴. 载体：经限制性酶酶切后形成的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆。一个DNA片段只有与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌和酵母人工染色体等。

⑵. 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶是基因工程的基石。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制或阻止病毒侵染。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一序列内将双链DNA分子切断。

⑶. 连接酶：将外源DNA与载体相连接的一类酶。

⑷. 宿主细胞：能使重组DNA进行复制的寄主细胞。

⑸. 氯化钠：主要用于DNA提取。在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加入一定浓度的氯化钠，使钠离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。另外，氯化钠也是细菌培养基的成分之一。

核基因库:是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。

构建方法是:尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片断，与适宜的载体连接构成重组DNA分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态细胞，收集所有的菌落即成为质粒基因库。如果载体是噬菌体或粘粒，则将重组DNA分子体外包装成噬菌体后，感染细菌细胞，将所得到的所有重组噬菌体集中即是基因库。如果载体为BAC或YAC，将重组人工染色体导入相应的宿主细胞，收集得到的所有细胞即成为基因库。

真核生物的核DNA大，因此在构建核基因库时，通常要选择能够接受较大片段的载体，以减少克隆数量。若构建的基因库是以分离结构基因为主要目的的，通常选用λEMBL，λGEM，或粘粒。而那些将用于基因组作图和分析的基因库，则多选择BAC或YAC为载体。